플라스미드에 연결할 때에는 DNA를 절단한 방법에 따라 다르다. cohesive-end방법에 의해서 DNA가 절단된 경우와, blunt-end방법에 의한 예는 다음과 같다. Eco R I에 의하여 절단된 DNA의 말단은 AATT의 염기순으로 되어 있고 Hind Ⅲ은 AGCT, Bam H I는 GATC의 염기순으로 되어 있다. 이들 말단 부위는 각각 분자의 반대쪽 말단의 상보적 사슬과 수소결합으로 결합하여 고리 모양 구조가 될 수도 있고, 또는 다른 DNA의 단편과 재결합 DNA를 형성할 수도 있다. 이들 결합은 DNA ligase에 의해서 연결되든지, 숙주에 도입된 후 숙주세포의 효소계에 의해서 공유결합으로 연결된다. 이 방법은 DNA절편을 연결하여 재조합 DNA를 만드는 데 가장 간단한 방법이며, 같은 제한효소를 이용함으로써 원래와 똑같은 DNA단편을 생산할 수 있다는 이점이 있다. Blunt-end 방법에 의해서 절단된 DNA의 절편은 T₄ DNA ligase에 의해서 서로 연결시킨다. 이 방법은 DNA의 절편을 그들의 말단 염
기 배열과는 관계없이 연결시킬 수 있어서 이점이 되고 있다. 또 다른 방법으로 호모폴리머 테일링(homopolymer tailing:單獨重合體精製化) 방법이 있다. 이것은 DNA단편들을 연결하기 위하여 일반적으로 가장 흔히적용하는 방법이다. 한 DNA절편의 한 가닥사슬의 끝에는 올리고(dA)를, 상대편 사슬의 다른 끝에는 올리고(dT)의 꼬리를 달아 이들의 상보적 염기쌍의 연결에 의해서 고리 모양의 재조합 DNA를 형성하는 방법이다. 호모폴리머 테일링에는 흔히 송아지의 흉선에서 추출한 터미널 뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제(terminal nucleotidyl transferase)라는 효소가 사용된다. 이런 여러 가지 방법으로 플라스미드 운반체에 실린 재조합 DNA는 숙주세포로 들어간다. 대장균은 CaCl₂로 처리하면 외부의 DNA를 받아들인다.
이 방법에 의해서 대장균, 살모넬라, Enterobacter, 슈도모나스 등에도 DNA에 의한 형질전환이가능하며 플라스미 드를 운반체로 사용한다. 대장균을 숙주로 사용할 경우에는 박테리아를 Mg2＋을 함유한 용액으로 씻고 4 ℃에서 Ca2＋ 용액에 현탁시켜 재조합 DNA를 이에 가하면 도입된 재조합 DNA에 의한 형질이 표현된다. 숙주세포는 재조합 DNA를 받아들일 수 있고, 도입된 재조합 DNA를 안전하게 복제하여야 하며, 또 재조합유전자의 유전정보를 발현시킬 수 있어야 한다. 대장균에서 핵산중간분해효소Ⅰ(endonucleaseⅠ)이 결여된 end A－ 이주는 야생주(野生株)보다 형질전환 효율이 높다. 도입된 재조합 DNA가 숙주의 제한효소계에 의해서 파괴를 받을 수 있기 때문에 제한효소 결여주를 숙주로 써야 한다. 또는 숙주세포의 DNA회복 유전인자들(rec gene)에 의하여 재조합 플라스미드의 구조가 변할 수 있기 때문에 이를 방지하기 위하여 rec A－ 변이주가 숙주로 자주 쓰인다. 또, 재조합 DNA의 존재가 발현되어 RNA와 단백질이 합성될 경우 숙주세포의 생장을 저해하거나 숙주세포에 독성을 주거나 또는 돌연변이율(突然變異率)을 높이는 경우도 있다.
참고문헌
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