과정
① 균의 오염을 막기위해서 무균실에서 실험진행
② tube에 펜으로 labeling을 해준다. 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6
③ 준비된 tube (total volume:1ml) 에서 균을 100μl만큼 Pipetting 해준다음
900μl의 H20가 들어있는 tube에 넣어서 total volume을 1ml로 맞춰준다. (⇒ 10-1 희석)
④ 10-1 희석된 튜브에서 같은 방식으로 100μl만큼 Pipetting 해준다음 각각의 tube에 넣어서 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 순서로 희석시켜준다.
⑤ 10-5만큼 희석한 것을 100μl만큼 Pipetting 해준다음 평판배지에 올려놓는다.
⑥ 준비된 삼각유리봉을 알코올에 담궜다가 알코올램프의 가열과정으로 살균시켜준 뒤 라벨링된 평판배지에서 spreading을 해준다.
⑦ spreading된 평판배지를 뒤집어 놓는다.
⑧ 10-6만큼 희석한 것 역시 ⑤~⑦과정을 반복해준다.
▶ 결과 :
총 10-5 희석시킨것의 colony개수 =236개
⇒ 236 x 105 = 처음 pipetting한 100μl 에 들어있던 colony의 수
⇒ 따라서 처음 pipetting 한 것은 total volume이 1000ul 있던 것의 10분의 1이므로
2.36 x 108 CFU / ml 이다.
총 10-6 희석시킨것의 colony개수 =29개
⇒ 29 x 106 = 처음 pipetting한 100μl 에 들어있던 colony의 수
⇒ 따라서 처음 pipetting 한 것은 1000ul의 total volume에서 10분의 1이므로
2.9 x 108 CFU / ml 이다.
▶ 고찰
① 균을 배양하기 때문에 추가적인 오염을 막기위해서 무균실에 들어가서 실험하였고, hood 내에서 실험을 진행하였다.
② 오차를 줄인 결과를 산출하기 위해서는 정확한 pipetting을 숙지해야 한다.
정방향 피펫질 (forward pipetting)
⇒
③ 희석배율에 따른 오차를 줄이기 위해서는 희석과정에서 각 tube의 H2O와 잘 섞일수 있도록 튜브의 뚜껑을 닫고 살짝 뒤집어서 섞어줘야 한다.
④ 삼각유리봉을 이용하여 spreading을 하는 과정 중에 삼각유리봉을 알코올을 이용하여 살균시켜줘야 하는데 삼각유리봉에 붙은 불이 완전히 꺼졌는지 확인해야 된다.
그리고 자칫 실수로 비커속의 알코올에 불이 붙더라도 비커를 살짝 덮어주어서 화재의 위험을 막아야 한다.
⑤ spreading 하는 과정중에 너무 힘을 가하면 배지가 탈락되는 일이 발생할 수 있기 때문에 적당량의 힘을 가해준다.
⑥ spreading은 평판배지를 돌리면서 유리삼각봉으로 균을 퍼뜨려주는데 이때 약간 뻑뻑한 느낌이 날때까지 문질러준다.
⑦ spread plating 과정 중에 평판배지 뚜껑으로 살짝 가린 상태에서 해준다면 추가적인 오염을 방지할수 있다.
⑧ spreading이 완료된 배지판 위에 뚜껑을 덥는 것이 아니라 뒤집어서 놓는다.
⇒ 그이유는 첫 번째로 뚜껑을 덮어서 직접적인 미생물의 오염을 막고 이며 두 번째로 뚜겅을 위에 덮어놓으면 배지내에 있는 수분이 증발하여 뚜껑에 맺혔을 때 그것이 다시 내려와 미생물 배양에 영향을 주거나 오염시킬 것을 방지하기 위해서이다.
-실험결론에 대한 고찰
10-5 희석시킨것의 colony개수 =236개 2.36 x 108 CFU / ml
10-6 희석시킨것의 colony개수 =29개 2.9 x 108 CFU / ml
오차는 5.4 x 107 CFU / ml 이다.
원래 정확한 희석과정이 이루어졌다면 10-6 희석시킨것의 colony개수 = 23~24개가 나와야 한다. 그런데 29개가 나왔다는 것은 충분한 희석이 이루어지지 않아서 균이 고르게 분산되있지 않은 상태에서 보다 많은 균이 pipetting 이 된것이라 추측할 수 있다.
실험2-b : biochemical Charcterization :
β-galactosidase activity
▶ 실험 날짜 : 2013. 10. 14
▶ 실험 준비물
-실험기구 및 도구 : 알코올램프, Pipet, 평판배지, 백금선, 펜
-미생물 : E.coli, pGEMT easy vector을 주입한 E.coli
-배지 : LB agar
▶ 실험과정
① 균의 오염을 막기위해서 무균실에서 실험진행
② 준비된 평판배지(LB agar)에 균들의 색 차이를 확인하기위해서 펜으로 구역을 나누어준다.
③ 백금선을 알코올램프에 달구어 빨갛게 변할때까지 끝까지 멸균해준다.
④ E.coli를 백금선으로 streak plating 해준다.
⑤ pGEMT easy vector을 주입한 E.coli 역시 ③~④을 반복해준다.
⑥ steak plating 된 평판배지를 뒤집어놓는다.
▶ 결과 :
E.coli 에서는 약간 흰색깔의 colony를 발견할수 있었고 pGEMT가 들어간 E.coli에서는 불빛에 비춰보았을 때 푸르스름한 색깔을 확인할 수 있었다.
▶ 고찰
① streak plating 과정을 위해서는 백금선의 멸균과정이 필요한데 백금선의 처음 부분부터 끝부분까지 붉은색으로 달구어질 때까지 충분히 멸균시켜준다.
② streak plating 은 균의 관찰을 위해서 중복되게 streaking 해주면 안된다.
- 결과에 대한 고찰
pGEMT에는 그림에서 보다시피 lacZ gene을 함유하고 있다.
lacZ gene은 β-galactosidase를 발현시켜서 X-gal을 X(5-Br-4-Cl-indole) 과 Galacotse로 분해하기 때문에 lacZ gene을 가진 E.coli는 생성물인 indigo에 의해서 푸른색을 띠게된다. 반면 대조군은 E.coli는 배지내에 들어있는 X-gal을 분해하지 못해서 하얀색을 띠게된다.
- LB agar 조성에 대한 고찰
X-gal : X-gal의 분해에 따른 생성물 확인을 통해서 베타 -galactosidase 의 발현유무를 확인시켜줄 수 있다.
IPTG : 대장균 락토오스오페론의 효소합성을 유도하는 강력한 유도물질
IPTG 가 repressor와 결합하여 오페론을 유도하는 inducer로 사용된다.